文獻賞析

華盈視角:蛋白芯片技術應用于砒霜靶點尋找

2019/01/22

    As2O3這一古老的中藥在急性早幼粒細胞白血病(APL)治療中的作用明確,并且對其它惡性腫瘤也具有顯著治療效果。As2O3直接作用靶點的鑒定是揭開其作用機理的最關鍵一環,然而該科學問題一直困繞著藥學研究領域的專家學者們,華盈生物緊密合作伙伴上海交通大學陶生策教授課題組研究人員,應用高通量的人類蛋白質組芯片技術找到了360個特異性的砒霜(As2O3)結合蛋白,這些蛋白很大一部分都參與了糖酵解通路。本研究揭示了As2O3通過抑制糖酵解途徑的限速酶己糖激酶2(HK2),抑制細胞代謝引發腫瘤細胞凋亡的作用機制。此外,這項工作中鑒定的As2O3結合蛋白有望成為開發協同抗腫瘤治療策略的寶貴資源。該研究成果被美國科學院院報(PNAS)收錄(PMID:26598702),同時被評為小分子藥物靶點研究的經典范文

 

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文獻解讀

 

 

 

 

 

1、As2O3靶標蛋白篩選

為了鑒定As2O3的結合蛋白,研究人員采用Huprot 20K人類蛋白質組芯片(覆蓋2萬種人類全長蛋白),該芯片是通過將As2O3生物素化,與芯片一起孵育,并添加Cy3-鏈霉親和素(Cy3-SA)鑒定As2O3的結合蛋白(圖1A)。因此,研究人員設置了實驗組As2O3-Biotin)和對照組(Biotin),為了確保結合的特異性,研究人員還設置了競爭組,即首先將100μM As2O3與芯片孵育,然后用10μM As2O3-Biotin +100μM As2O3與芯片進行孵育,發現As2O3-Biotin與芯片的結合都消失了。圖1B是隨機選擇的實驗組和對照組芯片上的相同區域,顯示實驗組有更多的陽性信號。最終,研究人員共鑒定出360種與As2O3直接相互作用的蛋白。圖1C展示了其中部分結合蛋白,其中PML是已知的As2O3結合蛋白。


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圖1 As2O3靶標蛋白篩選

 

2As2O3靶向糖酵解通路

為了深入了解As2O3結合蛋白的功能作用,研究人員使用DAVID數據庫對這360個結合蛋白進行GO分析和KEGGpathway分析,結果都顯示糖酵解相關蛋白的顯著富集(圖2A-B)。并構建了As2O3結合蛋白的相互作用網絡,其中最緊密連接的簇(Cluster 1)由參與糖酵解途徑或與糖酵解途徑高度相關的許多酶組成(圖2C)。為了評估在新鑒定的As2O3結合蛋白中是否存在共有序列,研究人員基于一級氨基酸序列進行了MEME基序檢索, 確定了許多蛋白包含半胱氨酸(圖2D)。該結果也與已知的As2O3對半胱氨酸的高親和力一致,特別是對于許多相鄰的半胱氨酸。


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圖2 As2O3靶向糖酵解通路

 

3As2O3與HK2結合并抑制其體外活性

鑒于As2O3結合蛋白的多數被鑒定為糖酵解酶,研究人員對As2O3結合及其對糖酵解的關鍵酶的功能性結果進行了更詳細的體外表征。其中糖酵解酶HK1是As2O3的結合蛋白,因此研究人員也對HK2進行研究。盡管HK2不在人類蛋白質組芯片上,但已知該蛋白在快速生長的腫瘤中維持高葡萄糖分解代謝率方面起關鍵作用,并且與HK1高度同源。因此,研究人員推斷As2O3也可能與HK2結合。WB實驗表明,As2O3與HK2及其他糖酵解酶結合,并且加入As2O3解毒劑BAL后,結合作用顯著降低(圖3A)。研究人員利用生物膜層干涉技術(BLI)測定PML和HK2對As2O3的結合親和力,發現它們與As2O3的相互作用相當強(Kd分別為860 nM和12.3 nM)(圖3B)。


進一步,研究人員使用鏈霉親和素瓊脂糖親和力測定法研究了As2O3是否直接結合細胞內的HK2。首先將HEK293T細胞與As2O3-Biotin一起孵育,將細胞裂解物與鏈霉親和素-瓊脂糖一起孵育以分離As2O3結合蛋白,然后通過變性將其與瓊脂糖解離并用抗HK2檢測。如圖所示,As2O3-Biotin確實與細胞內的HK2結合,并且這種結合可以通過預先加入As2O3而減弱(圖3C)。


接著,研究人員測定了As2O3結合HK2后對HK2活性的影響,發現2μM As2O3在體外急劇抑制HK2的活性,顯著降低葡萄糖-6-磷酸(G6P)反應產物(圖3D)。


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圖3 As2O3與HK2結合并抑制其體外活性


4、HK2過表達逆轉As2O3誘導的細胞凋亡

已有研究表明,As2O3處理癌細胞時會導致顯著的生長抑制和凋亡。因此,研究人員猜測As2O3對癌細胞的這些有害作用的可能機制之一是通過As2O3對HK2的抑制性結合來介導的。為了驗證這一假設,研究人員在胃癌細胞系SGC7901細胞中過表達HK2(圖3A-B),用As2O3處理這些細胞,并通過流式細胞術監測細胞凋亡。結果顯示,用As2O3處理細胞12小時后,在對照細胞中顯著誘導細胞凋亡(18.1%),但在HK2過表達的細胞中凋亡率降至1.32%(圖3C-D)。


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圖4 HK2過表達逆轉As2O3誘導的細胞凋亡

 

5、HK2是體內As2O3的靶標

因為As2O3與直接參與糖酵解通路的大部分酶結合并抑制HK2的活性,研究人員假設As2O3處理的癌細胞中該通路的許多代謝物將發生顯著變化。為了測試這種可能性,在胃癌細胞系SGC7901中進行了這些代謝物變化的系統分析。糖酵解的第一步和限速步驟由己糖激酶(癌細胞中的HK2)催化(圖5A)。代謝組學分析顯示,用As2O3處理12h的細胞中己糖激酶的直接產物G6P濃度低于對照細胞,甚至在24h更低(圖5B)。此外,用As2O3處理24h的細胞中乳酸的濃度(糖酵解程度的指數)也低于對照細胞(圖5C)。為了排除As2O3處理后改變了細胞中葡萄糖的濃度,而導致較低濃度的G6P和乳酸的可能性,對SGC7901細胞中葡萄糖的濃度進行研究,發現在所有時間點,As2O3處理細胞中葡萄糖的濃度與對照細胞沒有顯著差異(圖4D)。這些結果表明As2O3顯著抑制糖酵解,并表明抑制己糖激酶活性是細胞內這種作用的主要因素。


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圖5 HK2是體內As2O3的靶標


藥物靶點研究路線

 

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小結:

在本研究中,利用人類蛋白組芯片技術找到As2O3的直接結合蛋白對于揭開As2O3抗癌機制的大幕十分關鍵。在近30年的研究中,研究人員采用傳統方法找到的As2O3直接作用靶點不超過20個,大部分研究都是從轉錄組和蛋白表達調控水平去間接解釋As2O3的作用機理。陶生策教授的研究成果不僅讓學界對于As2O3的作用機理有了更新的認識。同時,該研究的技術路線為小分子藥物靶點的篩選和機制研究提供了新的技術示范。即通過蛋白質組芯片技術快速尋找經典小分子藥物的直接作用蛋白,闡明藥物調控機理。

人類蛋白組芯片在篩選互作蛋白研究中具有如下特征性優勢:

1. 芯片實驗為體外實驗,芯片上每個蛋白點相互獨立,保證篩選到的互作蛋白均為目標蛋白的直接結合蛋白,數據分析簡單。

2. 體內環境復雜,很多蛋白結合現象稍縱即逝,很難捕捉,利用體外環境條件下的篩選,可以很快發現很多潛在結合靶標,結合每個蛋白的生物學功能再進行后續實驗驗證的實驗策略更加高效,數據也更加全面。

3. 在不同組織、細胞、細胞器中,蛋白的表達豐度差異很大,傳統的CO-IP等實驗很難發現低豐度蛋白的互作現象,人類蛋白組芯片上的蛋白是酵母純化表達的蛋白,可以保證每種蛋白的豐度,芯片實驗容易發現潛在蛋白互作現象。

4. 利用人類蛋白組芯片實驗篩選互作蛋白,從蛋白質層面分析互作數據,避免了CO-IP后質譜鑒定時,從多肽水平跨層分析互作蛋白的不確定性和復雜性。

5. 相比酵母雙雜交實驗,蛋白芯片實驗周期短、假陽性率低,方便復雜實驗設計,可以設計多種實驗對照,更能確保互作蛋白數據的準確性。

 

英文文獻鏈接:

https://www.pnas.org/content/112/49/15084.long

 

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