文獻賞析

華盈視角:臨床醫生申請外泌體研究國自然的小竅門

2019/01/29

       外泌體是一種30-150nm的細胞外囊泡,其在疾病標志物、腫瘤微環境等研究領域中扮演著網紅般的角色。2018年,國家自然科學基金獲批項目中,外泌體相關項目高達418項,資助金額達17642萬元,相比2014年,增長近8倍,可謂異常火爆(圖1)。 

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圖1 歷年國自然資助外泌體項目統計數據


       那么外泌體研究的基本思路是什么?
       臨床醫生如何搭上外泌體這班快車,做點自己的小研究?

       看慣了CNS系列的微信帖子,總感覺科研離臨床醫生很遙遠…
       正值2019年國自然申請之際,華盈視角通過一篇經典的小文章為您傾情解讀外泌體研究的小竅門。

案例解析:適合普通臨床醫生的外泌體研究思路

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開篇三連問

       中國臨床醫生最大的優勢是什么?樣本!

       什么樣本?血清/血漿!

       最想做的研究是什么?臨床相關!

       有了上面三個問題的答案,我們想做和能做的研究基本有個輪廓了。給大家介紹的這個案例,影響因子雖然不高(IF= 2.959),但飽含著智慧的光芒。一起看看作者是如何開展研究的。


1. 關于樣本

       作者收集了108例結直腸癌(CRC)患者的血清樣本(敲黑板:病人平均隨訪時間是44個月,沒有健康組)(表1)。采用PEG富集的方法收集血清中的外泌體(超離更好,就是麻煩點)。

 

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表1 臨床樣本基線資料統計


2. 關于指標

       作者從以前研究結果中(也可以是別人的發表結果)找出miR‐548c‐5p這個miRNA作為本次外泌體研究的指標。原因很簡單,miR‐548c‐5p這個miRNA在CRC患者中明顯低于正常人群,因此,有理由相信在外泌體中,該miRNA有很大可能出現同樣結果(把miRNA換成蛋白也很有意義哦)。

       為什么?

       因為,有研究表明,血清/血漿中的miRNA約有70%以外泌體包裹的形式存在,所以無非是重復之前做的血清總miRNA的結果。(...此處省略1萬字


3. 關于實驗

       沒錯,作者用最普通的RT-PCR的方式,對miR‐548c‐5p在不同樣品中的表達量進行檢測,最終發現肝轉移的患者血清外泌體中的miR‐548c‐5p表達低于無肝轉移的患者,而外泌體miR‐548c‐5p與有無血管浸潤和淋巴結轉移無明顯相關性差異(圖2)(腫瘤表型有很多,耐心分析總能找到一個與外泌體相關的)。

 

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圖2 血清外泌體miR-548c-5p與腫瘤表型相關性分析


       由于這些樣品都有臨床隨訪資料,因此,可以將miR‐548c‐5p做為CRC病人生存率的一個獨立診斷指標。Kaplan‐Meier生存曲線分析顯示,血清外泌體miR‐548c‐5p表達量低的患者確實生存時間更短,P = 0.018。(由此看來,臨床樣本之間也有PK,關鍵要靠隨訪資料了…)

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 圖3 Kaplan‐Meier生存曲線分析


4. 關于外泌體功能

       最后,作者不忘初心,回歸到外泌體本身,畫龍點睛。外泌體是miR‐548c‐5p的轉運形式,在CRC患者中,miR‐548c‐5p低表達,那么是否預示著miR‐548c‐5p有降低結直腸癌成瘤性的可能?

       解決這個疑問的簡單辦法,就是加個細胞實驗

       作者選用經典的HTC116結直腸癌細胞系進行體外培養,將從高表達或低表達miR‐548c‐5p的CRC病人血清中分離的外泌體,加入HTC116細胞培養皿中進行共培養,CCK8實驗發現,miR‐548c‐5p高表達的CRC病人外泌體可以顯著抑制HTC116細胞的增殖(圖4)。 

 

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圖4 CCK8細胞增殖實驗檢測


        同時,熒光共聚焦顯微鏡下觀察EdU染色的HTC116細胞,同樣顯示miR‐548c‐5p高表達外泌體能夠顯著抑制HTC116細胞的增殖(圖5),自此為本研究畫上一個圓滿的小句號。

 

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圖5 熒光共聚焦實驗檢測

 

小結:

       看到如上的文獻解讀,臨床醫生朋友們是否覺得臨床科研,尤其是外泌體科研非常的親民,一點距離感都沒有?

       是的,只要醫生朋友們平常注意收集典型樣本(外泌體研究推薦血漿),遇到合適的時機,一篇有內涵的SCI文章其實離自己并不遙遠。

       其實,在外泌體研究領域所發表的文獻,無論影響因子多高,文獻中的基本研究思路無外乎以下四步:

 

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       如果您不具備外泌體實驗的相關條件,只要您有想法和樣品,您還可以借助華盈生物的平臺,實現自己的科研夢想。

       華盈生物是目前國內提供外泌體研究服務的標桿性企業,我們不僅自主研發了新型的EIQ3外泌體提取試劑盒,還打造了包括外泌體超速離心、外泌體NTA分析、外泌體透射電鏡拍攝、外泌體標志物蛋白Western Blot鑒定、外泌體蛋白質譜分析、外泌體分泌蛋白篩選、外泌體microRNA篩選、外泌體microRNA RT-PCR和數字PCR檢測等一整套完整的服務平臺,以幫助廣大科研人員實現外泌體研究的美好訴求。

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