文獻賞析

華盈視角:陳賽娟院士團隊發現白血病治療新靶點

2019/02/21

        2019年2月,華盈生物合作伙伴上海交通大學醫學院血液學研究所陳賽娟院士課題組在美國科學院院報(PNAS)上(PMID:30659143)在線發表了高三尖杉酯堿治療白血病的新機制。

 

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(HHT通過直接結合NFκB抑制因子下調MYC轉錄表達)

本文涉及LC-MS/MS技術和關鍵生物信息分析由華盈生物提供

       
        急性粒細胞白血病(AML)是一組造血系統惡性克隆性疾病,其特點是骨髓細胞分化受阻,成纖維細胞聚集。中藥高三尖杉酯堿(HHT)是一種蛋白質合成抑制劑,具有抗髓性白血病的作用,尤其針對t(8;21)亞型具有良好的預后效果。HHT對AML t(8;21)亞型的選擇性作用反映出其更多的抗白血病作用機制,那么,問題來了,HHT的作用機制是啥呢,該如何研究?

        本文作者通過HHT處理的t(8;21)小鼠白血病模型發現白血病發生的驅動因素MYC基因產生下調,并利用pull down實驗+蛋白質譜技術找到HHT的直接結合蛋白NKRF,發現其與MYC的間接調控作用,從而揭開系列作用機制。

 

華盈視角為您傾情解讀

1、HHT治療導致MYC基因表達下調

        研究人員在RUNX1-RUNX1T1和KITN822Kmut共表達t(8;21)小鼠白血病模型中,發現HHT對中白血病起始細胞(Lin?/Sca-1?/c-kit+;LICs)的活性有顯著的抑制作用,驗證了HHT的治療效果。

        隨后,在HHT處理的Kasumi-1細胞中,通過與未經HHT處理細胞的基因表達譜比較分析,MYC的表達在HHT處理的樣品中明顯降低(圖1A)。采用不同的HHT濃度研究了其對經典的靶向基因(包括MYC、CTNNB1和MCL1)蛋白水平和mRNA表達水平的影響,發現HHT引起MYC蛋白水平下調所需的濃度遠低于CTNNB1和MCL1;CTNNB1MCL1經過HHT作用后其mRNA表達水平不下降,而MYC的mRNA表達水平明顯下降(圖1B)。該結果說明HHT對MYC的下調是蛋白水平與轉錄表達水平不同機制的共同作用,而HHT對MYC的轉錄下調機制就是本文的新發現

        接下來,研究人員評估了6個AML細胞系Kasumi-1, SKNO-1, NB4, HL-60, U937和 THP-1中MYC的表達,發現MYC的轉錄水平與這6個細胞系對HHT的敏感性相關(圖1C)。結果表明,HHT可以減弱t(8;21) AML細胞中MYC基因的表達,并且下調作用可能與HHT的治療效果相關。

 

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圖1 HHT治療導致MYC基因表達下調

 

2、HHT靶向MYC轉錄調節因子NKRF

        HHT是如何調節MYC的,是直接作用還是間接作用呢?研究人員用生物素標記的HHT(bio-HHT)孵育Kasumi-1細胞裂解物,然后采用華盈生物Pull-down+蛋白質譜技術檢測與HHT作用的靶標蛋白。根據質譜檢測結果,華盈生物同時提供關鍵生物信息分析,最終作者分析得到在bio-HHT組中檢測到9種蛋白與MYC表達相關的差異蛋白。其中,6種位于MYC通路的下游(ABCD1, ABCD3, CLIC4, GLYR1, ASNS和ABCF3),3種位于MYC表達的上游(SRC, STAT1和 NKRF)(圖2A)。根據已知研究,SRC和STAT1能夠上調MYC的mRNA水平,而NKRF(NF-κB抑制因子)是一種通過抑制p65下調MYC表達的抑制劑。

        通過Streptavidin(SA)瓊脂糖親和試驗WB結果表明,只有NKRF能直接與Kasumi-1細胞中的HHT相互作用(圖2B)。研究人員還發現NKRF通過第二個雙鏈RNA結合基序(DSRM2結構域)直接與HHT結合。而一系列的缺失和突變實驗將HHT直接結合位點定位到DSRM2結構域的K479和C480氨基酸(圖2C)。

 

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圖2 HHT靶向MYC轉錄調節因子NKRF

 

3、HHT通過結合NKRF和激活p65信號下調MYC表達

        據報道,NKRF維持NF-κB處于非活性狀態,并抑制其下游MYC表達的激活。本文研究使用TNF-α來分析p65信號激活的結果,發現在TNF-α刺激的Kasumi-1 細胞中,HHT處理通過占據DSRM2結構域將NKRF從核(包括核仁)轉移到細胞質,促進p65-NKRF的相互作用,同時干擾p65-p50復合物的形成(圖3A),從而減弱p65對MYC基因的激活,而不涉及p65的經典翻譯后修飾(圖3B)。分別用靶向NKRF的shRNA(shNKRF)和雜亂shRNA(shSCR)轉染Kasumi-1和SKNO-1細胞,建立小鼠移植模型。在內源性NKRF被shRNA敲除50%后發現,敲除降低了HHT誘導的p65易位(圖3C),Kasumi-1細胞中HHT在下調MYC的過程中也明顯失去了作用(圖3D)。

 

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圖3 HHT處理后p65蛋白的激活情況

 

4、HHT對KIT表達的抑制與MYC下調相關

        據先前的研究報告,81.3%的t(8;21) AML患者可檢測到KIT的過度表達。在這里,研究人員觀察到37個原發性AML樣本中MYC和KIT表達之間的顯著相關性(圖4A),特別是在t(8;21) AML患者中(圖4B)。在用HHT處理24小時的Kasumi-1和Skno-1細胞中,KIT的mRNA和蛋白質水平與MYC一起下調(圖4C)。通過觀察發現,KIT和MYC表達的相關性進一步增強。

 

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圖4 KIT和MYC表達相關性


研究路線:

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小結:

       HHT是一種經典的中藥小分子,已應用于白血病治療30多年,以往對于HHT機制的認識一般為HHT通過抑制核糖體延伸過程中的mRNA翻譯起到治療AML的作用。本文利用小分子Pull-down實驗結合蛋白質譜技術篩選到HTT的直接結合NKRF蛋白(NF-κB抑制因子),并以NKRF蛋白為線索,通過深入的生信分析和文獻挖掘,找到了一條全新的HHT作用機制。即HHT通過直接結合NF-κB抑制因子NKRF下調MYC轉錄表達,通過下調MYC轉錄表達抑制KIT的表達從而達到t(8;21) AML良好的治療效果。 

        本文研究邏輯緊密,技術路線十分經典,為致力于尋找藥物靶標、探索其作用機制的研究人員提供了優秀的研究范本,值得推薦。

 

英文文獻鏈接:www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1818539116


蛋白質譜服務簡介

       華盈生物提供的蛋白質譜業務類型有:pull down+LC-MS/MS、Co-IP+ LC-MS/MS、 膠條鑒定Label freeiTRAQ/TMT等。可應用于藥物靶點、疾病標志物、發病機理、特殊功能蛋白質篩選、植物品種改良、工程菌改造等生物醫藥領域的大部分蛋白研究科研需求。

 

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