文獻賞析

華盈視角:高質量miRNA研究的正確打開方式

2019/03/12

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        miR-181a在白血病治療研究中顯示出良好效果和廣闊前景,然而,miR-181a在白血病尤其是慢性粒細胞白血病(CML)中的靶標與機制尚未確立。在本研究中,暨南大學基礎醫學院博士生導師、廣東省小核酸藥物開發工程中心主任費嘉教授及其團隊,利用多組學方法證明了受體型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)f多肽連接蛋白α1(PPFIA1)是miR-181a治療CML的直接靶標。華盈生物的磷酸化抗體芯片(CSP100)技術幫助研究人員確定了PPFIA1的效應分子KIT蛋白,顯示了利用miRNA-181a治療CML過程中,miRNA可通過直接抑制PPFIA1蛋白進而通過miR-181a - PPFIA1 - PARP1 - NF-κB-P65 - KIT調控通路,抑制CML細胞生長的作用機理。本文研究邏輯清晰,行文完整流暢,是值得大力的經典范文,文章于近期發表在國際期刊《Molecular Therapy-Nucleic Acids》(PMID:30825668)上。

 

華盈視角解讀:

1、PPFIA1是CML中miR-181a的直接靶基因

        首先,研究人員利用RT-PCR實驗對比了健康人、CML患者外周血單核細胞(PBMC)和CML細胞系(K562)中miR-181a的表達水平,發現miR-181a在CML患者PBMC和CML細胞系中均顯著下調(圖1A)。進一步,研究人員聯合SLIAC標記蛋白組學與基因芯片技術,系統性篩選了過表達miR-181a對于K562細胞系蛋白組和表達譜的影響(圖1C)。結果顯示,miR-181a的過表達導致了6,000種蛋白質和1,500種mRNA的表達水平下調。再利用靶標預測軟件進行分析,最終三種方法共同找到了15個miR-181a候選的靶基因。其中的PPFIA1受到miR-181a的抑制最為顯著,引起了研究人員的關注(圖1D和1E)。

接下來,研究人員通過RT-PCR和Western blot證實了過表達miRNA-181a確實會導致PPFIA1的mRNA和蛋白表達水平降低(圖1F)。進一步,在293T細胞中過表達miR-181a,利用雙熒光素酶報告實驗,證實了miR-181a是通過調控PPFIA1的3'UTR區抑制其轉錄和表達(圖1G),說明PPFIA1是miR-181a的直接調控靶標。

 

 

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圖1 PPFIA1是miR-181a的直接靶基因

 

2、miR-181a/PPFIA1-siRNA對CML的抑制效應

        接下來,研究人員首先比較了CML細胞與PBMC中的PPFIA1 mRNA的水平,發現在CML細胞和人CML樣品中PPFIA1均顯著下調(圖1B)。進一步,研究人員通過Transwell等體內實驗系統觀察了過表達miR-181a和抑制PPFIA1對于K562細胞一系列表型的影響,結果顯示miR-181a或PPFIA1-siRNA可顯著增加K562對伊馬替尼(imatinib)的敏感性(圖2A),降低腫瘤細胞的遷移能力和集落形成能力(圖2B/2C)。過表達PPFIA1顯著抑制伊馬替尼對K562細胞的殺傷作用(圖2D),增強腫瘤細胞的遷移能力和集落形成能力(圖2E/2F),說明PPF1A1具備成為CML治療靶點的潛力。


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圖2 miR-181a/PPFIA1-siRNA對CML的抑制效應

 

3、PPFIA1-siRNA對CML小鼠模型的治療效應

        為了探索PPFIA1-siRNA治療CML的潛力,研究人員用106熒光素酶標記的K562細胞靜脈注射NOD-PrkdcscidIL2rgtm1 / Bcgen(NSG)小鼠,并通過生物成像監測siRNA的治療效果。21天后,與用NC-siRNA和載體對照處理的小鼠相比,PPFIA1-siRNA顯著抑制小鼠中K562-熒光素酶細胞的生長(圖3A/3B),并顯著增加模型小鼠的體重(圖3C)。同時, PPFIA1-siRNA處理的模型小鼠的存活時間也顯著延長(圖3D)。這些結果表明PPFIA1-siRNA可能是治療CML的有廣泛前景的藥物。



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圖3 PPFIA1-siRNA對CML小鼠模型的治療效應

 
4、PPFIA1-siRNA抑制CML的作用機理

        那么,PPFIA1-siRNA抑制CML細胞系表型的機理是什么?

        面對復雜的細胞內信號網絡,研究人員首先想到了利用磷酸化抗體芯片技術對PPFIA1-siRNA調控的腫瘤相關信號通路進行全面篩選,選擇了華盈生物的CSP100廣篩磷酸化抗體芯片技術,同時對12條腫瘤信號通路的132個磷酸化位點進行全面篩選。將轉染PPFIA1-siRNA 72小時后的K562細胞進行CSP100芯片篩選(圖4A),發現多個重要蛋白受到PPFIA1-siRNA的調控(圖4B/4C),其中抗體芯片顯示腫瘤增殖關鍵蛋白KIT(Tyr721),P38 MAPK(Tyr182)和VEGFR2(Tyr951)均顯著下調(圖4D)。

        大量文獻表明KIT蛋白與CML發病機制密切相關,研究人員推測miR-181a可能是通過抑制PPFIA1進一步調控KIT蛋白的活性進而實現抑制CML的效果。進一步,通過K562細胞系中穩定過表達PPFIA1和PPFIA1-siRNA抑制PPFIA1的對比實驗,觀察干預PPFIA1對KIT蛋白表達和磷酸化的影響,證實了KIT(Tyr721)確實受到了PPF1A1的調控。同時,KIT 蛋白下游的Akt和ERK1/2也顯示出了一致的結果(圖4E/4F)。

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圖4 PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

5、下游研究:找到PARP1直接結合蛋白PPFIA1/ABL1

        為了探索PPFIA1對KIT的調控機制,研究人員通過co-IP結合質譜分析,發現PARP1與K562細胞中的外源性PPFIA1和內源性BCR相關(圖5A)。為了確定PPFIA1-PARP1和ABL-PARP1是否直接結合,研究人員又進行了計算機分子對接模擬和表面等離子體共振成像(SPRi)分析。分子對接結果表明PARP1和PPFIA1及ABL1可以直接結合(圖5B/5C/5D)。同時,研究人員純化了ABL的每個結構域并進行了SPR測定。SPR的結果證實ABL1的F-actin結構域可以與PARP1結合,與分子對接分析的結果一致(圖5E)。

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圖5 PARP1和PPFIA1/ABL1直接結合

 
6、PARP1的作用機理

        已有研究表明,PARP1可以在腫瘤中調節重要的信號通路NF-κB,增加促腫瘤轉移的細胞因子的釋放。因此,研究人員假設PARP1是通過促進P65轉錄水平來實現其相關功能的。為了研究PARP1與P65之間的關系,研究人員通過奧拉帕尼(Olaparib)抑制PARP1的表達檢測P65的表達情況。抑制PARP1表達水平后,P65及其磷酸化均下調(圖6A-6C)。此外,通過siRNA干擾抑制P65表達導致KIT的下調(圖6D-6F)。這些結果表明PPFIA1能與PARP1 蛋白結合,促進P65轉錄進而激活KIT磷酸化及下游信號通路,引起CML惡性進展(圖6I)。

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圖6 PARP1通過激活NF-κB-P65轉錄促進KIT表達

        接下來,為了探索抑制PARP1治療CML的潛力,研究人員研究了奧拉帕尼對穩定表達PPFIA1的K562細胞的作用。結果顯示,奧拉帕尼顯著抑制了K562-PPFIA1細胞的集落形成能力(圖6G)。并且,用奧拉帕尼處理的動物比用載體對照處理的動物存活時間更長(圖6H)。綜上,所有證據表明抑制PARP1是一種有廣泛前景的治療CML的方法。

小結:

        在本研究中,研究人員利用磷酸化抗體芯片技術分析PPFIA1-siRNA治療CML的作用機制,成功鎖定到KIT通路,最終揭開其作用機制:PPFIA1與PARP1蛋白結合,促進P65轉錄進而激活KIT磷酸化信號通路,增強CML惡性進展。當生物現象背后可能調變的通路有很多,無法確定時,可以選擇廣譜信號通路磷酸化抗體芯片,如PEX100芯片,一次芯片實驗即可實現31條信號通路的同步篩選,幾乎涵蓋胞內所有常見的信號通路,為后續生物現象的深入探索提供明確的研究方向。或選擇CSP100芯片,可實現腫瘤相關的12條信號通路的同步篩選,找到關鍵調變位點,在腫瘤的發生、發展、轉移、耐藥、復發、微環境等機制研究發揮重要作用。同時,由于疾病信號通路的共性特點,CSP100抗體芯片也成為其它疾病研究中信號通路篩選的重要工具。

英文文獻鏈接:https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.01.015

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